蜂产品(蜂蜜、蜂王浆)药物残留快速检测手册

天马蜂2011-09-10 19:23:42蜂产品其他应用2629

本手册简单介绍了蜂产品药物残留的危害,检测现状及检测方法,并对各种常用的检测方法的优劣进行了比较。对蜂产品生产企业及进出口企业如何以较低成本建立自己的质控体系也做了阐述。对在野外如何现场进行检测蜂产品原料进行了重点论述。

本手册可供各蜂产品生产企业从事原料采购、成品质量检控的技术人员参考,可以供各蜂产品生产企业的负责人在建立企业内部质控体系时参考。

一、为什么要检测蜂产品中药物残留?

1.蜂产品中药物残留现状

我国是世界蜜源和养蜂大国,也是蜂蜜出口大国。现有蜜蜂600多万群,年产蜂蜜约20万吨,每年出口约10万吨。目前我国养蜂大多以一家一户的粗放式养殖为主,加之国家并未对蜂蜜中药物残留实施严格的检测标准,这无疑加大了蜂蜜出口“绿色化”的难度。一些地区的蜂农根本不愁销,即使抗生素达不了标,河南、陕西、湖北及浙江省等地蜂蜜加工厂照样抢购,弄得出口企业即使愿出较高价也不一定能买到合格的蜂蜜。尽管出口企业和农民的思想意识都在逐渐转变,但与国际接轨还有相当距离。如养蜂中,若天气太潮湿,蜜蜂会得一种腐烂病,只要用好一点的蜂蜜喂养,就会自然痊愈。但许多蜂农仍然采用喷洒氯霉素的方式,造成氯霉素在蜜蜂体内存积超标,甚至影响到蜜蜂的第二代、第三代。

2.药物残留的危害

2.1氯霉素(Chloramphenicol)氯霉素是一种广谱抗生素,具有良好的抗菌和药理特性,被广泛应用于蜜蜂的各种传染病的防治。但是氯霉素对人和动物的骨髓细胞、肝细胞产生毒性作用,可导致再生障碍性贫血;婴儿可出现致命的“灰婴综合症”。氯霉素在食品中的残留浓度高达1mg/kg以上时对食用者的有严重威胁,因此成为第一个被世界各国禁用于食品动物的抗生素。

2.2磺胺类(Sulfonamides,SAs)磺胺类药物是一类具有广谱抗菌活性的人工合成药物,主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。由于其易残留在动物体内,对人有严重的副作用,尤其是致癌性物质磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine,SM2),严重的反应表现在血液系统的有粒细胞减少或缺乏、贫血、血小板减少,对体内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏者可致正铁血红蛋白血症和溶血性贫血。

2.3四环素类(Tetracyclines,TCs)四环素(Tetracycline)、土霉素(Oxytetracycline)、金霉素(Chlortetracycline)同属于四环素类抗生素,由于容易诱导耐药菌株和导致食品残留,包括我国在内的许多国家对四环素类残留实施例行监控。

2.4氨基糖苷类(Aminoglycosideantibiotics,AGs)链霉素(Streptomycin)和双氢链霉素(Dihydrostreptomycin)同属于氨基糖苷类抗生素,均具有耳毒性和肾脏毒性,能损害脑神经、耳蜗神经,对近端肾曲管有损害,造成血尿、肾功能衰退等。

2.5喹诺酮类(Quinolones,QNs)恩诺沙星(Enrofloxacin)和环丙沙星(Ciprofloxacin)属喹诺酮类药物,能引起中枢神经系统不良反应,而且有潜在的致癌性和遗传毒性,同时还容易使病菌产生耐药性。

2.6有机磷农药(OrganophosphorusPesticide,OP)有机磷农药多为高毒性、高残留,易造成水源、食品、农作物、环境等污染,严重威害人体健康。人中毒后会出现头昏、头痛、恶心、呕吐、腹痛、腹泻和呼吸困难等症状,重度者可出现肺水肿、昏迷、呼吸衰竭、脑水肿。

2.7其它药物主要是种类繁多的杀虫剂,均对人体健康有不同程度的危害。

3.抗生素残留对蜂产业的影响

我国是蜂产品出口大国,在日益激烈的国际市场竞争中,面临着越来越大的压力。除了恶性竞争、进口国的反倾销诉讼外,以药物残留为主的绿色贸易壁垒已成为制约我国蜂产品出口的主要因素之一。2002年8月28日,美国海关在从中国进口的近500吨散装蜂蜜中检测出低浓度氯霉素,并将这批蜂蜜全部扣留。2002年初,欧盟以我国产蜂蜜含有氯霉素等抗生素超标为由,全面禁止我国动物源性食品进境。与此同时,世界各国先后抬高门槛,对我国的蜂蜜产品提出苛刻的要求,欧盟国家的许多商场还陆续将中国产蜂蜜撤下柜台,停止出售。此外,加拿大对中国的蜂蜜产品也在农、兽药残留(15项磺胺,4种抗生素和250多种杀虫剂残留)等方面提出了苛刻的要求。尽管去年7月解除了这一禁令,但欧盟关于进口蜂蜜中氯霉素残留的检测标准仍然十分苛刻:10万吨蜂蜜中氯霉素含量不得超过1克。若再检测出超标,生产企业将会被列入“黑名单”而被逐出欧盟市场。

二、蜂产品中药物残留的检测要求和现状

1.国内外相关法律法规

下表引自“浙江蜜蜂网”,统计了我国几个主要的蜂产品出口国家和地区关于蜂蜜、蜂王浆中药物残留限量要求,其中具体内容和数据由浙江出入境检验检疫局提供。

蜂产品(蜂蜜、蜂王浆)药物残留快速检测手册

此外,欧盟还根据牛奶中药物残留标准对蜂蜜中其它药物残留标准进行了规定,包括恩诺沙星、环丙沙星在内的多种抗生素。

2.蜂产品中药物残留检测主要技术及在应用中的局限

目前,蜂产品中药物残留的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液质联用技术(HPLC/MS/MS)、气质联用技术(GC/MS/MS)、微生物法、酶联免疫法(ELISA)和CharmⅡ等。这些方法大多具有灵敏度高、重复性好等特点,有些方法已成为国家标准,特别是色谱法更具有确证能力。但是,这些方法难以在普通蜂农甚至中小型企业中普及应用,无法实现野外快速检测。归其原因主要有以下几种:s费用昂贵:首先是仪器,色谱法的仪器动辄十万,甚至百万。稍微便宜的如ELISA、CharmⅡ也需要配套几万的设备。s操作复杂:从样品处理到最后得到结果,需要几个小时甚至过夜,其间的操作过程需要几步到十几步,并且要求操作人员具有高度的专业知识及熟练的操作技能。s检测环境:由于仪器的精贵、样品处理的复杂,因此对操作环境的温度、湿度、通风、光照以及有毒物质的排放都有严格要求,设施涉及无菌操作间、通风橱、排污管道、掩埋装置等,这就要求检测必须在符合规定的实验室中进行。ELISA、CharmⅡ和微生物法等相对其它方法而言,仪器费用相对较低,在几万元左右;操作人员需要一定的专业培训;但对实验设施的要求仍然较高,必须在符合规定的实验室中进行。

三、胶体金免疫层析技术在野外检测中的应用

1.胶体金免疫层析技术简介

20世纪90年代,在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来了一种新型检测技术——胶体金免疫层析法(ColloidalGoldImmunochromatographicStripAssay,GICA)。胶体金免疫层析技术在医疗诊断领域应用广泛,包括乙肝、艾滋病、梅毒等病毒的快速检测,以及海洛因、吗啡、可卡因、摇头瓦等毒品的快速检测。其具有快速、灵敏、特异、简便等优点。随着人们对食品安全的日益重视和进出口贸易的高速增长,迫切需要一种能快速、稳定地检测药物残留的方法。胶体金免疫层析快速检测技术开始逐渐应用于蜂产品中农兽药残留的现场快速检测。胶体金免疫快速检测技术具有以下优点:

简单:操作人员不需要专业知识,样品处理及检测过程操作简单,即普通大众就能按说明书独立使用;

廉价:不需要配置其他仪器、设备,肉眼观察结果,产品本身亦很廉价;

快速:可以在几分钟内得到检测结果;

准确:根据免疫学原理进行检测,可特异性识别药物,灵敏度高、重复性好;

无毒:该产品成分对人体无害,对环境无污染;

易保存:不需要特殊的保存条件,在流通和使用环节均在室温环境即可。

2.胶体金快速检测试剂简介

目前,本公司已开发出检测蜂蜜、蜂王浆中氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、环丙沙星+恩诺沙星、有机磷农药的胶体金快速检测试剂,并在产品包装中配套有检测过程需要的所有试剂和器具,同时可根据用户需要进行增减。

2.1几种胶体金快速检测试剂的技术指标介绍如下:

①氯霉素检测项目:灵敏度:0.3ppb;特异性:与其他药物无交叉反应;样品处理时间:20~30分钟;检测时间:5分钟左右肉眼判断结果,10分钟后判断无效;

②磺胺二甲基嘧啶检测项目:灵敏度:10ppb;特异性:与其他药物无交叉反应;样品处理时间:10~20分钟;检测时间:5分钟左右肉眼判断结果,10分钟后判断无效;

③有机磷农药检测项目:灵敏度:见表2;

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注:1ppm=1000ppb特异性:与其他种类药物无交叉反应;样品处理时间:20~30分钟;检测时间:5分钟左右肉眼判断结果,10分钟后判断无效;

④环丙沙星检测项目:灵敏度:50ppb;特异性:可同时检测恩诺沙星,与其他药物无交叉反应;样品处理时间:10~20分钟;检测时间:5分钟左右肉眼判断结果,10分钟后判断无效;

2.2胶体金快速检测试剂的外观、结构及原理

胶体金快速检测试剂的外观图:

蜂产品(蜂蜜、蜂王浆)药物残留快速检测手册

该图中为胶体金快速检测试剂的两种主要形式:胶体金快速检测试剂条和胶体金快速检测试剂板。s胶体金快速检测试剂的结构图:

胶体金快速检测试剂的原理:

当试剂条插入待检样品后,样品溶液由于层析作用开始往上移动。假如样品中有药物残留,药物将和指示剂上的抗体先行反应,因此当指示剂移动至固定在膜上的药物位置时,指示剂上抗体的活性位点将因被样品中的药物占据而无法与膜上药物结合,所以当样品中的所检药物含量达检测线以上时,测试条上的测试线将较对照线呈色淡或甚至无呈色,判定为阳性。反之,当样品中药物含量在检测线以下或无残留时,测试条上的测试线呈色与对照线相近偏深,判定为阴性。

3.胶体金快速检测试剂在野外检测中的应用

在这里仅以氯霉素检测为例简要说明胶体金快速检测试剂在野外检测蜂蜜、蜂王浆中药物残留的具体使用方法和适用范围。

3.1氯霉素检测试剂的配套工具除电吹风外,均在产品中配套包装,也可用户自备试剂和工具,均可以随身携带。试剂:乙酸乙酯、样品提取液(浓缩液,使用前用纯净水稀释);器具:15ml离心管、试管、塑料吸管、钟表、移液枪(可选);设备:家用电吹风、加热水浴工具(二选一)。

3.2氯霉素检测的样本处理整个样品处理过程在野外,如蜂农宿营地,即可完成,具体操作方法如下:

1取蜂蜜于15ml离心管中至“3”标志线(约4g)处,若检测蜂王浆需再加约2ml水溶解样品;

2加入乙酸乙酯至“11”标志线(约8ml)处,若检测蜂王浆则加至“13”标志线处;

3剧烈振荡摇匀5~8min后,移取上清于试管中至上标志线(约6ml)处,用电吹风吹干或在80℃以上的水浴中挥发干;

4加入样品提取液至下标志线(约0.3ml)处,振荡溶解残留物,待检。

3.3氯霉素检测试剂的使用

整个检测过程仅需肉眼观察即可,时间在5~8分钟。

1从包装袋中取出试剂条(或板)。

2若为试剂条,则按箭头方向插入试管的样品提取液中,待有颜色液体扩散到试剂条中央白色膜面后,取出试纸条;

3若为试剂板,则用滴管吸取试管中样品提取液滴加到试剂板的加样孔中;

4在5-8分钟读取结果。其它时间判读结果无效。

3.4结果判断

具体的结果示意图见下页

1阴性(-):在测试区和质控区各出现一条红色色带时,T线(测试线)比C线(对照线)深或一样深,表示样品中氯霉素浓度低于0.3ppb。

2阳性(+):在测试区和质控区各出现一条红色色带或仅质控区出现一条红色色带时,T线比C线淡,表示样品中氯霉素浓度高于0.3ppb。

3无效:质控区(C)未出现红色色带,表明不正确的操作过程或试剂条已变质失效。在这里可以看出C线是作为产品质量的自检部分,可由用户自主监测。

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试剂板结果示意图

四、关于企业建立蜂蜜检测实验室的解决方案

对于蜂制品加工和进出口企业来说,如何保障蜂蜜原料的质量安全,减少因药物残留超标造成的损失,已越来越成为关注的重点。对于大多数企业来说,由于较传统的方法,如色谱法等,存在仪器设备昂贵、需要复杂的样品前处理、操作人员需要经过严格培训等不足,因此难以实现企业的自主检控,一般为送相关机构检测,这样造成检测样本少、单个费用高,当蜜源为零散的蜂农时,就很难保证蜂蜜质量;即使资金实力雄厚的企业,要自建检测实验室,也面对着高昂的实验室建立成本和单个样本检测成本。针对以上情况,结合胶体金快速检测试剂和酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒,本章节将为蜂产品相关的加工和进出口企业提供一套成本较低、检测效率较高的实验室方案,除野外现场可进行的氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、环丙沙星+恩诺沙星、有机磷农药四项定性检测指标外,还包括四环素类(四环素、土霉素、金霉素)、磺胺类、链霉素、氯霉素和部分杀虫剂在内的定量检测指标。该方案为一通用模式,与企业本身已有的实验室并不冲突。若仅采用胶体金快速检测试剂,则与野外现场检测一样,直接采用家用电吹风或家用加热设备即可。

下面提供的是检测上面提到的所有指标时对实验室的要求。各企业可根据实际情况进行选择,以建立适合本企业的检测实验室。

1.对基础设施的要求

1.1实验室位置:

实验室的位置最好设在距离生产车间、锅炉房、交通要道稍偏远,避免有害气体、烟尘的侵袭,避免振动。

1.2实验室布局:

实验室室内面积在20~30平方米即可,分为实验检测区、样品存放区以及档案区。实验室的主要设施有实验台、通风系统等。实验台的安放最好使光线从侧面射入,并有日光灯照明。在实验台侧面设有水盆,下水管应耐腐蚀。实验台需设有试剂架或试剂柜,也可另设试剂柜。实验台还需设有电源插座。

1.3实验室通风系统

通风系统一般为通风橱,也可设置排气罩或全室通风。通风橱一般长1.5~1.8米(单个),深0.8~0.85米,空间高度大于1.5米。前门安装上下推拉式玻璃门。内有照明、排水装置,内壁最好涂防腐层。排气口应高于屋顶2米以上。

2.对设备配置的要求

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3.对实验器具的要求

常用的实验器具包括:玻璃器皿类:烧杯、广口试剂瓶、量筒、试管等;塑料器具类:离心管、定量可调移液器、移液器枪头、试管架、离心管架、洗瓶等;其它实验用品:称量勺、记号笔、试管刷、称量纸等;预算:2000~3000元人民币。

4.常用的试剂

包括一些常用的化学药品,如:有机溶剂:乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、二氯甲烷等;固体试剂:氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、TWEEN20等;酸类:盐酸、硫酸等;其它:洗涤剂、去污剂等;还有一些特殊的试剂可根据检测试剂盒的提供厂家的要求进行配置,一般情况下,上述试剂即可满足要求。预算:500~1000元人民币,每月消耗费用低于100元。

5.人员配置及办公用品

一般人员配置在1~2名即可。另外,为了及时记录检测结果,形成样本档案,还需在实验室配备办公用品,如笔、纸、文件夹、笔记本等。预算:500元人民币(不包括人员开支)。预计单个样本单个指标的平均检测成本(包括设备折旧、试剂损耗及人力费用)在50元人民币左右。

6.大致操作规程和要求

6.1抽样

根据企业的管理制度对相应样本进行抽样,并对抽取样本进行编号,规则如下:

□□□□-□□

抽样序号(如:05代表第5个抽样样本)抽样日期(如:0829代表8月29日)每个样本编号与各企业的取样对象须一一对应。

6.2样品处理

每个样本需混合均匀,再用称量勺转移需要量的样品到离心管中,并对离心管进行编号;不同样本之间切勿混合,处理新样本前,需使用蒸馏水清洗样本处理用器具。样品处理过程中,需对使用的离心管、试管等,对应所盛装的样品进行编号。具体编号可以参看上述“抽样”栏。各器具在一天的检测后要彻底清洗干净:先用洗衣粉洗泡,再自来水冲洗,最后用纯净水洗净。天马蜂,加我们的微信一起学养蜂。

6.3检测及结果记录

根据检测试剂的使用方法进行检测,对应样本记录检测结果,冷藏保存样品,并根据检测结果进行相应的处理。